Benutzer:Lindahlh/USER fusion (Uracil Specific Excision Reagent)
Das Klonen mit Uracil Specific Excision Reagent (USER) ist eine benutzerfreundliche Klonierungsstrategie, die das Klonen von bis zu mehreren DNA-Fragmenten an spezifischen Positionen in einem Vektor in einem Schritt ermöglicht. Daher ist diese Klonierungsstrategie der klassischen auf Restriktionsenzymen und Ligasen basierenden Klonierung in Bezug auf Geschwindigkeit, Effizienz und Einfachheit überlegen.
Die Technik beruht auf Primern mit vektorspezifischen Überhängen, die eine einzelne Desoxyuridin-Base (Uracil) enthalten, die zur Amplifikation eines gewünschten DNA-Fragments in einer PCR-Reaktion verwendet wird. Das PCR-Fragment wird dann mit dem USER-Enzymgemisch (Uracil-DNA-Glykosylase und DNA-Glykosylase-Lyase Endo VIII) behandelt, um einzigartige 3'-Überhänge zu bilden, die komplementär zu den im Vektor vorhandenen 5'-Überhängen sind.
Um komplementäre Überhänge im Vektor bilden zu können, muss dieser eine USER-Kassette enthalten. Ein Beispiel für eine USER-Kassette ist eine PacI-Restriktionsstelle, die von zwei Nt.BbvCI-Nicking-Stellen flankiert wird. Durch Hinzufügen des Restriktionsenzyms PacI wird ein Doppelstrangbruch eingeführt, der, gefolgt von der Freisetzung von Nt.BbvCI 7 Basen stromabwärts der PacI-Stelle, einen 9bp langen 5'-Vektorüberhang bildet (Abbildung 1B). Dieser Überhang muss komplementär zu dem im PCR-Fragment gebildeten Überhang sein, damit eine Basenpaarung stattfinden kann. Die Basenpaarung zwischen den 9 komplementären Basen ist stabil genug, um den Vektor mit dem eingefügten Fragment in E. coli zu transformieren, wo das Plasmid durch das körpereigene DNA-Reparatursystem zusammen ligiert wird.[1]
Einzelnachweise[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]
- ↑ Rasmus JN Frandsen, Jens A Andersson, Matilde B Kristensen, Henriette Giese: Efficient four fragment cloning for the construction of vectors for targeted gene replacement in filamentous fungi. In: BMC Molecular Biology. Band 9, Nr. 1, 2008, ISSN 1471-2199, S. 70, doi:10.1186/1471-2199-9-70 (doi.org [abgerufen am 14. Mai 2024]).